Σε ηλικία 16 ετών έκανε περιοδεία με την «Αρκούδα» του Αντόν Τσέχωφ. Τέσσερα χρόνια αργότερα, το 1963, ήρθε ο πρώτος μεγάλος ρόλος του Ντε Νίρο όταν εμφανίστηκε στο «Τόπο στα Νειάτα» του Μπράιαν Ντε Πάλμα, που ήταν και η αρχή μιας πολύχρονης συνεργασίας με τον σκηνοθέτη. Η ταινία όμως δεν κυκλοφόρησε επίσημα πριν από το 1969.
Το μεγαλύτερο διάστημα της δεκαετίας του '60 το πέρασε σε θεατρικά εργαστήρια και σε παραστάσεις εκτός του Μπρόντγουέι. Είχε ένα μικρό ρόλο στη Γαλλική ταινία του Μαρσέλ Καρνέ «Τρία Δωμάτια στο Μανχάταν» και επανασυνδέθηκε με τον Ντε Πάλμα για τα «Greetings»και «Γεια σου Μαμα... Αμερική!».
Κέρδισε τα βλέμματα πολλών όταν εμφανίστηκε στο «Bang the Drum Slowly» ενώ την ίδια χρονιά ξεκίνησε και η συνεργασία του με τον Μάρτιν Σκορσέζε όταν συμπρωταγωνίστησε με τον Χάρβεϊ Καϊτέλ στους «Κακόφημους Δρόμους». Αυτό οδήγησε σε μια σειρά ταινιών μεταξύ τους όπως τα «Ο Ταξιτζής», «Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη», «Οργισμένο είδωλο», «Βασιλιάς για μια Νύχτα», «Τα Καλά Παιδιά», «Το Ακρωτήρι του Φόβου» και «Καζίνο».
Σε όλες αυτές τις ταινίες, ο Ντε Νίρο υποδυόταν κάποιον με αντικοινωνική συμπεριφορά. Μια από τις πιο σημαντικές ταινίες για την καριέρα του ήταν ο «Ταξιτζής», όπου ο ρόλος του Τράβις Μπικλ εκτόξευσε την δημοτικότητα του και την καριέρα του. Στην ίδια ταινία περιλαμβάνεται και ο γνωστότατος «You talkin' to me?» μονόλογος του.
